Pourquoi deux tests ne sont pas égaux ?
L’équipe scientifique de Primerdesign explique sa démarche pour la conception de ses tests dans un article de leur blog. Nous tenons à le partager avec vous.
Dans cet article, nous passerons en revue les problèmes techniques de la conception des amorces ou sondes si elles ne sont pas élaborées aux normes requises. Le processus de conception est une partie charnière dans la production d’une amorce ou d’une sonde qui va rendre son utilisation valable ou non.
Une amorce bien conçue est essentielle pour réaliser une réaction PCR fonctionnelle et pour assurer des résultats quantitatifs, précis et interprétables lors d’un test qPCR. Beaucoup de facteurs sont à prendre en compte lors de la conception de ces amorces pour le gène ciblé. Voici quelques conseils pour la création d’amorces.
Avant de commencer, il faut réfléchir au gène et les variantes à saisir pour la conception. Il est recommandé de faire des recherches rapides pour s’assurer que les séquences soient spécifiques à la cible.
Pourquoi une cible vaut mieux que deux cibles ?
Si vous choisissez deux cibles, il est difficile de trouver deux bonnes conceptions : si l’une est bien conçue et la seconde l’est moins, cela peut donner des résultats discordants ; il faut donc s’assurer que les deux cibles sont basées sur des bonnes informations de séquences. Le test double cible a été créé car à l’origine, le séquençage était cher et chronophage. Maintenant, avec l’épidémie de Coronavirus COVID-19, des séquences sont publiées partout dans le monde, tous les jours à un rythme jamais atteint. Nos scientifiques « maison » ont réalisé un profil génomique du virus pour suivre les mutations et la validité de notre test. Ils seront immédiatement au courant si le kit de dépistage ne détecte pas une de ces séquences. La question est : pourquoi avoir besoin d’un ciblage double gènes alors que cela implique des prix plus élevés, doubles réactifs et dans certains cas un temps plus long pour obtenir le résultat ?
La cible du test.
La cible du test est importante. Nous choisissons des régions hautement préservées du génome dans nos tests, y compris pour notre test du COVID-19, car si le génome commence à accumuler des mutations, elles sont moins susceptibles d’apparaître dans une région du gène préservée. Lorsque vous souhaitez utiliser une séquence, il est toujours utile de vérifier les bases de données, de façon régulière. Cela permet de réaliser une vérification complète pour identifier les mutations dans les cibles d’amorces ou de sondes. Des séries de bases répétées supérieures à 4 signifient que cela pourrait donner un amorçage non spécifique et qui pourrait conduire à des faux positifs, par exemple des bases répétées comme ACCCC ou ATATATAT.
Si vous concevez un test, il est meilleur de sélectionner une région où le génome à un taux de probabilité de mutation bas. Notre kit, par exemple, est spécifiquement conçu pour cibler une région qui a un taux de mutation très bas, identifiée par nos experts. Si le test cible une région qui peut muter, cela donnera plus facilement des faux-négatifs. Si l’on double les cibles, on double les chances de mutation et de fait les chances de faux-négatifs.
Choisir une bonne conception va réduire les risques de dimères d’amorces dans l’analyse, ce qui limite la fonction du test et réduit sa sensibilité ; cependant, une conception adéquate en réduit les risques de formation. Une des façons d’éviter cela est d’utiliser un logiciel de conception de test qui évite les modèles et les structures d’amorce-dimère pour améliorer l’efficacité de la PCR.
Dans la conception d’un test pour le gène CDC COVID-19 N1 il est prévisible que les formations de boucles entrainent une boucle en épingle à cheveux qui est rejetée par le logiciel de conception Primer3. Ces formations de boucles peuvent causer des problèmes pendant la PCR, entraînant une efficacité d’amplification plus faible et de faux négatifs potentiels.
La qualité d’un test est directement liée aux informations données par le logiciel et il est donc très important de les analyser correctement.
Sources : PrimerDesign.co.uk
